Spermatozoidų morfologijos vertinimas: išsamūs tyrimai ir jų reikšmė gyvūnų reprodukcijai

Reproduktorių vaisingumas sutrinka dėl įgimtų lytinių organų patologijų, netinkamo šėrimo bei laikymo, temperatūros stresų. Daugeliu atvejų šių veiksnių sukeltos patologijos galima išvengti nuolat ir detaliai tiriant reproduktorių spermą. Labai dažnai egzogeninių faktorių sukelti spermatogenezės proceso pokyčiai neturi įtakos spermatozoidų koncentracijai, judrumui, spermos kiekiui. Tačiau morfologiškai ištyrus spermatozoidus, paaiškėja, jog dažnai patologinių jų formų esti daugiau negu leistina. Spermos tyrimai parodė ją esant labai nevienodos kokybės. Todėl gaminant spermą, klinikinį androloginį bulių bei spermos morfologinį tyrimus reikia atlikti sistemingai.

Lietuvoje, kaip ir daugelyje pasaulio šalių, kiaulės sėklinimui naudojama neatšaldyta sperma. Kuilio spermos kriokonservavimą riboja specifinės kuilio spermatozoidų membranos sudedamųjų dalių savybės, dėl kurių didelis spermatozoidų kiekis žūsta ją atšildant. Todėl spermos tyrimai yra atliekami veislininkystės įmonių laboratorijose prieš atskiedžiant spermą.

Spermatogenezė ir spermatozoido sandara

L. D. Russel et al. (1990) ir I. Gordon (2004) apibūdino spermatogenezę kaip ciklinį ir labai stipriai koordinuotą procesą, prasidedantį sėklidės spermatogeninio epitelio ląstelių dalijimosi ir diferenciacijos procesu, kurio metu sėklidžių sėkliniuose kanalėliuose gaminamos vyriškosios lytinės ląstelės - spermatozoidai. Šios apvaliosios spermatidės turi pereiti visą kompleksą pasikeitimų, iki bus suformuotas spermatozoidas (De Kretser and Kerr, 1988). Pagal De Kretser et al. (1998), spermiogenezės metu vyksta spermatidės struktūrinės ir morfologinės pasikeitimų seka. Formuojasi uodegėlė ir ašies mikrovamzdeliai, branduolio chromatinas kondensuojasi ir juda į branduolio periferiją, formuojasi akrosominė kepurėlė, formuojanti akrosomą, taip pat formuojasi redukcinis kūnelis, nuimantis didelę dalį citoplazmos, kurią vėliau pašalina Sertolio ląstelės.

Kadangi kiaušinėlį apvaisina tik vienas iš kelių milijardų spermatozoidų, todėl visa spermatozoido sandara pritaikyta greitai judėti. R. S. Jeyendran (2003) spermatozoidą apibūdino kaip paprastą, bet labai diferencijuotą ląstelę. W. V. Holt et al. (1984) rašo, kad visa spermatozoido architektūra atsispindi jo plazminėje membranoje, kuri lyg dėlionė funkciškai ir biochemiškai skirtingai atitinka pagrindinius galvos ir uodegėlės segmentus.

Spermatozoido galvutė

Galvutė yra padalyta į du didelius segmentus - priekinį akrosomos segmentą ir užpakalinį poakrosominį segmentą. Galvutės citoplazminės organelės yra akrosoma, branduolys ir branduolio apvalkalas, prikibęs prie branduolio. Akrosoma apsupta membranos ir savyje turi hidrolizinius fermentus, itin svarbius akrosominėje reakcijoje apvaisinimo metu. Akrosoma - tai lyg branduolio kepurėlė priekinėje galvutės dalyje. Ji taip pat apibrėžia akrosominio segmento ribas. Akrosomos membrana perskirta į dvi sritis, kurios skiriasi viena nuo kitos savo molekuline sandara. Poakrosominiame segmente esantį branduolį supa specializuotas citoskeleto kompleksas - branduolio apvalkalas.

Plazminė membrana apjungia abu - akrosominį ir poakrosominį - segmentus, akrosomą bei sudedamąsias branduolio apvalkalo dalis, kurios struktūriškai reorganizuojasi spermatozoidui išėjus iš sėklidės bei pradedant bręsti antsėklidyje. Išorinė akrosomos membrana prisišliejusi prie plazminės membranos, o vidinė akrosomos membrana prisiklijavusi prie branduolio paviršiaus. Akrosomos segmentai atlieka itin svarbų vaidmenį per apvaisinimą pirminio bei antrinio įsiskverbimo į spindulinį vainiką ir akrosomos hidrolizinio fermento išleidimo metu, taip pat vidinė akrosominė membrana sąveikauja su kiaušinėlio plazma. Spermatozoido akrosomos dažniausiai yra pažeidžiamos spermatozoidus atšildant.

Spermatozoido kaklelis ir vidurinė dalis

Šioji spermatozoido dalis yra trumpas segmentas, jungiantis uodegėlę ir spermatozoido galvutę. Ji sudaryta iš segmentuoto vamzdelio ir tankios pluoštinės struktūros (D. W. Fawcet (1965); M. R. Curry and P. F. Watson (1995)). Aplink save ji turi spiraliai apsivijusias mitochondrijas, kuriose generuojama energija uodegėlės judėjimui (M. R. Curry and P. F. Watson, 1995). Spermatozoido energijos gaminimo vieta yra vidinė mitochondrijų membrana.

Spermatozoido uodegėlė

Uodegėlė - svarbiausia dalis spermatozoido judrumui. Pagrindinė uodegėlės dalis tęsiasi nuo žiedo (annulus) iki galinės dalies kartu su pluoštine makštimi. Struktūriškai uodegėlė padalyta į tris dideles sritis: kaklelio, vidurinės dalies ir galinę dalį. Taip pat joje yra judrumą generuojantis aparatas, mitochondrija, aksonema ir citoskeleto struktūros - išorinis tankusis audinys ir pluoštinė makštis (D. W. Fawcet (1965); H. Pedersen (1970)).

Aksonema tęsiasi beveik per visą uodegėlės ilgį. Ji susideda iš dviejų centrinių mikrovamzdelių, susijungusių sąsajomis, bei apsuptų devyniomis mikrovamzdelių poromis (9+2 išsidėstymas) (D. W. Fawcet, 1965; H. Pedersen, 1970). Aksonemos kompleksas yra prijungtas prie plazminės membranos užtrauktuko principu, dviejų eilių, ovalo formos, vidumembraniniais daleliais, gretimais išorinėms tankiosioms skaiduloms. Toks susijungimas suteikia geresnį judesio veiksmingumą negu jis būtų, jei aksonema būtų neprisitvirtinusi ir judėtų plazminės membranos apvalkale (D.S. Friend and D. W. Fawcett, 1974; G. C. Enders et al., 1983).

1959-1961 metais mokslininkai: B. A. Afzelius (1959), I. R. Gibbons ir A. V. Grimstone (1960), R. Gibbons (1961), nustatė, kad kiekvieno mikrovamzdelio A subvienetas sujungtas dyneino baltymo rankute, kuri leidžia gretimai mikrovamzdelių porai slysti greta viena kitos. Taip aksonema susilenkia ir sukelia uodegėlės judėjimą. H. Pedersen (1970) taip pat nustatė, kad kiekviena iš devynių periferinių porų turi A subvienetą, esantį O formos ir formuojantį pilną mikrovamzdelį, bei B subvienetą, esantį C formos bei savo laisvais galais prisijungusį prie A subvieneto. Centrinė makštis, supanti du centrinius mikrovamzdelius, susideda iš dviejų pluoštų, susisukusių spiraliai. Gretimos mikrovamzdelių poros yra sujungtos neksino sąsajomis (R. E. Stephens, 1970) tarp A ir B subvienetų (B. Baccetti et al., 1985).

Veiksniai, turintys įtakos spermatozoidų gyvybingumui ir morfologijai

Moksliniai tyrimai, tiriantys įtaką spermatozoidų gyvybingumui, prasidėjo nuo 1677 metų, kada Antonijus Leeuwenhoekas atrado judrų spermatozoidą žmogaus ejakuliate. R. Knox et al. (2008) teigė, kad atsižvelgiant į tai, jog kiaulės dažniausiai apvaisinamos jas sėklinant surinkta ir atitinkamai apdorota kuilio sperma, labai svarbu nustatyti veiksnius, kurie veikia spermatozoidų gyvybingumą. Taip pat labai svarbu suprasti, kurie veiksniai veikia spermatozoidų gyvybingumą nuo pat spermos paėmimo, laikant ją atskiestą skiedikliu, iki panaudojimo sėklinimui.

Reaktyvūs deguonies radikalai (ROS) vaidmuo yra svarbus lipidų peroksidacijoje, kuri žaloja plazminę spermatozoidų membraną. 1970 metais mokslininkai J. I. Jones ir D. R. Mann atliko eksperimentą, kurio metu į avino spermą buvo pridėta Fe2+, kas lėmė spermatozoidų kvėpavimo dažnio sumažėjimą. Šis tyrėjų teigimu, yra kelios pagrindinės priežastys, dėl kurių ROS sukelta lipidų peroksidacija padaro spermatozoidą tokiu pažeidžiamu. Spermatozoidas yra unikaliai sukurta ląstelė, nuo spermatogenezės iki kiaušinėlio apvaisinimo pereinanti eilę pasikeitimų.

E. Kommisrud et al. tyrė spermą saugant ilgiau nei 78-102 valandas. Tyrimo metu buvo vertinamas judrumas bei akrosomos vientisumas. Judrumas sumažėjo nuo 79,8 proc. po 6 valandų laikymo iki 78,4 proc. po 102 valandų laikymo. Spermatozoidų su normaliomis akrosomomis procentinis kiekis nuolat mažėjo viso tyrimo metu. Po 6, 30, 54, 78 ir 102 valandų spermatozoidų su normaliomis akrosomomis atitinkamai buvo 93,9 proc., 90,6 proc., 88,0 proc., 84,8 proc. ir 78,2 procento. Judrumui didžiausią įtaką turėjo kuilys (p<0.001) bei spermos koncentracija dozėje (p<0.01).

Ožių spermos kriokonservavimo ir kokybinių rodiklių tyrimas

Darbo tikslas buvo įvertinti atšildytos ožių spermos kokybinius rodiklius po kriokonservavimo, palyginti parametrus, tirtus iš karto po atšildymo bei praėjus 2 valandoms po inkubacijos 37°C temperatūros vandens vonelėje bei palyginti rezultatus tarp dviejų pieninių ožių veislių. Buvo tirti 7 pieninių veislių ožiai (4 Zaaneno veislės ir 3 Alpių veislės). Kiekvieno ožio buvo analizuojami 2 spermos mėginiai: vienas tirtas iš karto po atšildymo, kitas - praėjus 2 valandoms inkubavimo vandens vonelėje, palaikiusioje 37°C temperatūrą.

Tirti parametrai: spermatozoidų koncentracija spermos dozėje (mikroskopuojant ir SCA metodu), spermatozoidų judėjimo parametrai (subjektyviai ir SCA metodas), spermatozoidų gyvybingumas (mikroskopija) bei morfologija (mikroskopija).

Tyrimo metu nustatyta, kad vidutinė visų ožių spermatozoidų koncentracija dozėje buvo 424,71 ± 15,11× 106. Didžiausia koncentracija buvo Alpių veislės ožių (459,00 ± 2,31 × 106 spermatozoidai dozės mililitre). Spermatozoidų judrumo procentas po atšildymo buvo 57,14 ±1,55. Alpių ožių judrumas tiek po atšildymo, tiek praėjus 2 valandoms inkubacijos išliko vienodas (60 proc.), o Zaaneno veislės ožių iš 55 proc. sumažėjo iki 43,75 proc. Vidutinis visų ožių spermatozoidų progresyvaus judėjimo vidurkis po atšildymo siekė 52,57 ± 2,19 proc. Didžiausias progresyvus spermatozoidų judėjimas po atšildymo buvo Alpių ožių (65 proc.).

Abiejų veislių ir bendras visų ožių spermatozoidų gyvybingumas iš karto po atšildymo buvo vienodas (68 proc.) vertinant eozino - nigrozino dažymo metodu. Po dažymo SYBR-14/PI dažais aukščiausias vidurkis buvo Alpių veislės ožių (4,43 proc. didesnis nei visų ožių ir 7,75 proc. didesnis nei Zaaneno veislės ožių (p < 0,05)). Praėjus 2 valandoms inkubavimo mažiausiai pakito Alpių veislės procentas (nukrito 1 proc. (p < 0,05)).

Bendras vidutinis patologinių spermatozoidų kiekis vienoje dozėje po atšildymo buvo 9,43± 2,80 proc. Mažiausias spermatozoidų patologijų dozėje vidurkis buvo Alpių ožių spermoje (3,33 ± 1,20 proc.). Dažniausiai pasitaikiusios buvo kitos patologijos (palaidos patologinės galvutės, akrosomų pakitimai, distaliniai ir proksimaliniai lašeliai) - Zaaneno ožių spermoje šis patologijų vidurkis siekė 8,50 ± 2,60 proc.

Bulių lytinės sistemos ir spermos tyrimai

Morfologinis ir funkcinis bulių spermos įvertinimas

Šio darbo tikslas - išanalizuoti 16 brokuotų bulių lytinę sistemą - atlikti makroskopinį ir mikroskopinį sėklidžių ir antsėklidžio tyrimą, atlikti šaldytos, šviežios ir paimtos iš antsėklidžio buliaus spermos tyrimus (ištirti spermos spermatozoidų judrumą, koncentraciją, patologinius spermatozoidus). Analizė buvo atlikta 2018-2019 metais LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje ir LSMU VA patologijos centre - skrodimo salėje. Iš viso tirtos 32 bulių sėklidės (kairioji ir dešinioji), 8 šviežios spermos mėginiai (4 - pirmosios ejakuliacijos ir 4 antrosios ejakuliacijos), 16 šaldytos spermos mėginių ir 12 spermos mėginių, paimtų iš antsėklidžio. Iš viso buvo ištirti 36 spermos mėginiai. Darbo metu buvo atlikti bulių sėklidžių ir antsėklidžio matavimai, stebėta, ar nėra makroskopinių arba mikroskopinių patologijų. Sėklidžių dydžiai palyginti su gautais spermos tyrimų rezultatais, stebėta, kaip vieni spermos tyrimų rezultatai susiję su kitais spermos tyrimų rodikliais.

Šaldytos spermos tyrimo metu nustatyta, kad vidutinis spermatozoidų judrumas visuose spermos mėginiuose buvo 61,5 ± 12,6 proc. Tik vienas spermos mėginys neatitiko bendrųjų bulių spermos reikalavimų, jo spermoje esančių spermatozoidų judrumas buvo 38 proc. (norma > 40 proc.). Šviežioje spermoje esančių spermatozoidų judrumas atitiko normas - vidutinis spermatozoidų judrumas pirmojoje ejakuliacijoje buvo 83,5 ± 9 proc., o antrojoje vidutinis spermatozoidų judrumas buvo mažesnis - 79,5 ± 16 proc.

Tiriant spermatozoidų morfologiją nustatyta, kad visi spermos mėginiai atitinka minimalius leistinus patologinių spermatozoidų skaičius procentais, kurie yra nurodomi bendruosiuose bulių reikalavimuose (PG % > 10 proc., PU % > 15 proc.). Vidutiniškai pirmajame šviežios spermos ejakuliate buvo rasta 8,25 ± 2,5 proc. patologinių spermatozoidų, o antrajame ejakuliate - 7,7 ± 2,2 proc., o šaldytos spermos mėginiuose vidutiniškai kiekviename spermos mėginyje nustatyta 4,7 ± 1,7 proc.

Klinikinė-androloginė bulių spermos analizė

Trijose veislininkystės įmonėse 37 ketverių-šešerių metų amžiaus buliai buvo tiriami pagal klinikinį androloginį tyrimo planą. Jų sperma tirta morfologiškai, prieš tai nustatant spermatozoidų koncentraciją bei judrumą. Ištyrus bulius, 27 % nustatyti įvairūs pakitimai - prielipo galvutės disfunkcija, spermos granulioma, sėklidžių, pūslinių liaukų konsistencijos pakitimai. Buliai suskirstyti į grupes pagal sveikatos būklę: 1 grupė - sveiki, 2 grupė - su pakitimais. Spermatozoidų koncentracija 1 grupėje buvo 6,5% didesnė, bei 1,5 % geresnis judrumas nei 2 grupėje (p < 0,05). Bendras patologinių spermatozoidų procentas 1 grupėje ir 2 grupėje buvo atitinkamai 5,5 % ir 28,5 %.

Ilgalaikis kuilių spermos saugojimas ir jo įtaka kokybei

The present study was conducted to determine the influence of long storage and qualitative sperm parameters on motily, velocity and viability of boars spermatozoa and also a correlation of motility, velocity, viability and morphology. Tyrimui buvo naudojami 33 skirtingi kuilių ejakuliatai. Klasikiniais metodais buvo vertinama pirminės spermos dozės koncentracija, morfologija, judrumas bei akrosomos būklė. Sperm velocity was assesed by SCA, viability by hypo-osmotic swelling test by using 100 mOsm/L sodium citrate fructose solution. Motility, morphology and acrosome integrity were assesed using conventional semen evaluation methods. Judrumas, gyvybingumas, judėjimo greitis ir akrosomos būklė buvo vertinami po 6, 30, 54, 78, 102 ir 150 valandų, nuo spermos surinkimo, spermos dozes laikant 17°C temperatūroje.

Storage time had a significant influence on motility, viability and velocity while they both declined and had a significant correlation (pd"0.01) with each other. Nustatyta, jog spermatozoidų judrumas bei gyvybingumas patikimai teigiamai koreliavo (pd"0.01) abiem mažėjant, ilgėjant spermos saugojimo laikui. To determine the influence of abnormal sperm morphology on motility, viability and velocity each semen sample was divided into two groups. First group was with less than 10 percent of abnormal morphology, while the second group was with the greater than 10 percent of abnormal morphology.

I grupės spermatozoidai iki 102 valandų buvo gyvybingesni vidutiniškai 8,7 ± 1,2 proc., lyginant su II grupės, o po 102 valandų, kai II grupės spermatozoidai jau buvo sumažėję žemiau kritinės 40 proc. gyvybingumo ribos, I grupės gyvybingumas vis dar buvo 45,93 procento. Spermatozoidų judrumas II grupėje kontrolinę 60 proc. judrumo ribą kirto po 78 valandų, o I grupės judrumas - tik po 102 valandų. Statistical analysis of the data revealed a significant (pd"0.01) positive correlation between motility and sperm viability determined by percentage of HOT test positive spermatozoa.

There was a significant (pd"0.05) negative correlation betwen the abnormal head morphology with HOT test and cytoplasmic droplets with motility. The velocity (VCL, VAP, VSL) declined while LIN and STR inclined and WOB did not showed any significant changes throughout the experiment. There was no significant influence of sperm morphology on velocity. Surprisingly, the influence of spermatozoa concentration was just on the VSL, LIN and STR with a significant (pd"0.05) positive correlations. Means for percentage of spematozoa with normal acrosomes showed a small decline from 99.73 % after 6 h of storage to 98.91 % at 150 h.

tags: #riskeviciene #v #zilinskas #h #spermatozoidu #morfologijos

• Dirbtinis apvaisinimas: svarbiausi faktai ir iššūkiai
• Priežiūra naujagimiams
• Sužinokite, kaip gauti vienkartinę išmoką už vaiko gimimą
• Vaikų ugdymas nuo žaidimo iki pažinimo
• Lopšelio-darželio ugdymo vadovo pareigų aprašas